Neuer Biosensor beleuchtet physiologische Signale in lebenden Tieren

Eric Schreiter und Luke Lavis glaubten, die Lösung gefunden zu haben. Im Jahr 2021 gaben Beamte der Janelia Group bekannt, dass sie eine Möglichkeit entwickelt hatten, die von Schreiter und Janelia Fluor entworfenen Protein-Biosensoren mit Fluoreszenzfarbstoffen von Lavis zu kombinieren.

Diese Sensoren, die in der Lage sind, verschiedene physiologische Signale zu erkennen und sie mit tiefrotem Licht zu beleuchten, würden es Wissenschaftlern theoretisch ermöglichen, lebende Tiere abzubilden und mehrere physiologische Signale gleichzeitig zu verfolgen, zwei Aspekte der biologischen Bildgebung, die mit vorhandenen Sensoren nur schwer zu erreichen sind. Fernrotes Licht kann tiefer in das Gewebe eindringen als andere Wellenlängen und bietet Wissenschaftlern eine zusätzliche Farbe, die sie über die typischen Farbtöne wie Grün und Rot hinaus nutzen können, die in der biologischen Bildgebung verwendet werden.

„Alles lief super, es war fantastisch und wir waren glücklich, bis wir versuchten, die Sensoren bei Tieren anzuwenden, und es scheiterte“, erinnert sich Schreiter. „Es war ein wenig enttäuschend. »

Glücklicherweise war Helen Farrants gerade für ihren Postdoc-Aufenthalt in Schreiters Labor bei Janelia angekommen, und sie nahm die Herausforderung an, die Protein-Biosensoren neu zu entwickeln, um ihren ursprünglichen Zweck zu verwirklichen.

Von Grund auf neu entwickelte Farrants eine neue Möglichkeit, Proteinbiosensoren und JF-Farbstoffe zusammenarbeiten zu lassen, sodass das Team sein Ziel erreichen konnte, physiologische Signale in lebenden Tieren zu messen. Ihr erster Proof-of-Principle-Sensor namens WHaloCaMP kann Kalziumsignale – eine Schlüsselkomponente der zellulären Kommunikation – in lebenden Fruchtfliegen, Zebrafischen und Mäusen erkennen.

Diese neue Technik kann auch zur Entwicklung einer Reihe von Sensoren zur Verfolgung anderer interessanter Signale verwendet werden. Die Fähigkeit, diese physiologischen Signale in lebenden Tieren zu beobachten, könnte Biologen Einblicke in die Zusammenarbeit von Zellen, Geweben und Organen bei der Erfüllung wichtiger Funktionen geben.

„Helen hat bei Null angefangen, bei Null, und die gesamte Strategie neu aufgebaut, um Farbstoffe und Protein-Biosensoren zu kombinieren“, sagt Schreiter. „WHaloCaMP ist die erste Demonstration, aber es wird nicht die letzte sein. Dies wird wirklich eine neue allgemeine Strategie auf dem Gebiet der Herstellung fluoreszierender Biosensoren für die physiologische Bildgebung sein, insbesondere im fernen Rotbereich. »

Öffnen Sie einen neuen Pfad

Das größte Hindernis, das Farrants und sein Team überwinden mussten, bestand darin, einen anderen Weg zu finden, den Protein-Biosensor und den JF-Farbstoff zusammenarbeiten zu lassen.

Die ersten vom Team entwickelten Sensoren verwendeten Farbstoffe, die sich in Fluoreszenz umwandelten. Diese Farbstoffe konnten jedoch nicht in tierisches Gewebe eindringen, ein Problem, das deutlich wurde, als das Team versuchte, den Sensor an lebenden Tieren anzuwenden und keine Signale erkennen konnte.

Nachdem Farrants mehr als ein Jahr lang verschiedene Strategien ausprobiert hatte, kam er auf die Idee, bestimmte Teile des Sensorproteins zum Ein- oder Ausschalten der Fluoreszenz zu verwenden, anstatt eine Formänderung des Farbstoffs zu nutzen. Das Team fügte dem biotechnologisch hergestellten Proteinsensor in der Nähe des angebrachten Farbstoffs eine Aminosäure namens Tryptophan hinzu. Wenn der Farbstoff in engen Kontakt mit Tryptophan kommt, erlischt der Farbstoff. In Gegenwart von Kalzium verändert das Protein seine Form: Das Tryptophan entfernt sich vom Farbstoff und dieser leuchtet auf.

„Anderthalb Jahre lang hat nichts funktioniert, aber ich erinnere mich an den Tag, als ich diese Umstellung auf Tryptophan vornahm und eine winzige Veränderung in der Fluoreszenz sah, als ich Kalzium hinzufügte. Ich wusste, dass wir zumindest einen Ausgangspunkt hatten, dass wir einen Haken hatten“, erinnert sich Farrants.

Sehen Sie sich die Signale an

Die Verwendung von Tryptophan zur Modulation der Farbstofffluoreszenz hat die Verwendung von Farbstoffen ermöglicht, die leicht vom Gewebe absorbiert und in lebenden Tieren verwendet werden können.

Die Forscher zeigten, dass WHaloCaMP zur Erkennung von Kalziumsignalen in lebenden Fruchtfliegen, Zebrafischen und Mäusen verwendet werden kann. Sie zeigten auch, dass es mit anderen Sensoren verwendet werden kann, um bis zu drei Signale gleichzeitig in unterschiedlichen Farben zu erkennen. Bei Zebrafischen zeigten sie, dass sie gleichzeitig Veränderungen der Glukose in Zellen, Kalziumsignale in Muskeln und Kalziumsignale in Neuronen erkennen konnten.

Das Team arbeitet derzeit mit dem GENIE-Projektteam von Janelia an der Entwicklung einer verbesserten Version von WHaloCaMP. Sie arbeitet auch mit Biologen bei Janelia zusammen, um die neue Strategie zur Entwicklung von Sensoren zur Erkennung anderer physiologischer Signale und zur Herstellung von Sensoren mit zusätzlichen JF-Farbstoffen zu nutzen. Das Team machte seine Strategie zum Bau von Biosensoren auch der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich, und andere Gruppen begannen mit der Entwicklung zusätzlicher Versionen der Sensoren.

Laut Farrants wäre das Projekt ohne die Interaktion und Zusammenarbeit bei Janelia nicht möglich gewesen, die es ihr und anderen Chemikern ermöglicht, Werkzeuge zu entwickeln, die Biologen brauchen und wünschen.

„Ich bastele und erstelle wirklich gerne Werkzeuge, aber wenn ich weiß, dass das, was ich baue und woran ich bastele, eine Anwendung hat, an der jemand interessiert sein wird, dann ist es meiner Meinung nach der Grund, warum es Spaß macht und lohnend ist.“ , erklärt Farrants. „Das ist es, was ich an Janelia mag: Man kann täglich mit Menschen interagieren. Das passiert auch in der weiteren wissenschaftlichen Welt, aber Janelia ist ein besonderer Ort. »