Forscher enthüllen die zugrunde liegenden Mechanismen, die CRISPR zu einem wirksamen Werkzeug zur Genbearbeitung machen

CRISPR/Cas9 ist ein Gen-Editing-Tool, das die biomedizinische Forschung revolutionierte und zur ersten von der FDA zugelassenen CRISPR-basierten Gentherapie führte. Bisher war jedoch der genaue Mechanismus, mit dem dieses Tool funktioniert und schädliche Effekte außerhalb des Ziels vermeidet, nicht genau verstanden.

Jetzt haben Forscher am Children’s Hospital of Philadelphia (CHOP) mithilfe modernster Technologie mehrere spezifische Schritte identifiziert, die erforderlich sind, damit CRISPR aktiv wird und seine Gen-Editierungsfunktion erfüllt. Diese präklinischen Ergebnisse könnten zu verbesserten Designs für die CRISPR-basierte Genbearbeitung führen. Die Ergebnisse wurden heute in der Fachzeitschrift veröffentlicht Zelluläre chemische Biologie.

Durch die Genbearbeitung kann genetisches Material im Genom einer Person hinzugefügt, entfernt oder auf andere Weise verändert werden. Im Gesundheitswesen besteht ein enormes Potenzial zur „Reparatur“ mutierter Gene, die die Grundlage für viele seltene und komplexe Krankheiten bilden. Damit die Genbearbeitung jedoch effektiv ist, muss sie präzise sein und darf nur an einem beabsichtigten Ziel verändert werden.

Während in klinischen Studien seit 2020 die direkte Abgabe von Cas9 an Patienten über Lipid-Nanopartikel zur Genbearbeitung untersucht wird, bleibt die breite Anwendbarkeit eine Herausforderung. Cas9 hat das Potenzial, unbeabsichtigte Veränderungen am Genom außerhalb des Zielgens vorzunehmen, die schädlich sein und sogar Zellen krebsartig machen können.

Daher werden einem Patienten entnommene Zellen zur Genbearbeitung außerhalb des Körpers verwendet, bevor sie an den Patienten zurückgegeben werden. Dies ist ein kostspieliger und zeitaufwändiger Prozess, der auf einem unvollständigen Verständnis der Mechanismen der Genbearbeitung beruht.

„Wir hatten immer den Verdacht, dass das, was wir an den vorhandenen Strukturen des Gen-Editing-Prozesses sehen konnten, uns nicht die ganze Geschichte erzählte“, sagte der Hauptautor der Studie, Nikolaos G. Sgourakis, Ph. D., außerordentlicher Professor am Center for Computational and Genomic Medizin am CHOP und außerordentlicher Professor in der Abteilung für Biochemie und Biophysik der Perelman School of Medicine der University of Pennsylvania.

In dieser Studie nutzten die Forscher eine Technik namens Kernspinresonanzspektroskopie, um Atome und Proteine ​​und ihre Dynamik zu visualisieren und zu beobachten, wie sie sich zwischen verschiedenen Zuständen bewegen. Mit dieser Methode konnten Forscher den Übergang von CRISPR von einem inaktiven in einen aktiven Zustand und die dazu erforderlichen Schritte beobachten, was ohne diese fortschrittliche Ausrüstung nicht möglich war.

Eine zwischengeschaltete „Wachhund“-Struktur funktioniert wie ein Korrektor innerhalb eines Fließbandes und dient als Pförtner zur Regulierung der DNA-Schneideaktivität des Enzyms. Dieser Schritt ist wichtig, um Off-Target- und On-Target-DNA-Sequenzen anhand des Cas9-Proteins zu unterscheiden, das seiner programmierbaren Leit-RNA entspricht, einer kurzen Sequenz, die die DNA-Bearbeitung an präzisen Stellen im Genom steuert.

Es gibt viele technische Varianten von Cas9, und Varianten mit höherer Genauigkeit fördern die Ziel-DNA-Erkennung und tragen dazu bei, den „Überwachungs“-Komplex zu stabilisieren, während dies geschieht, wodurch Off-Target-Effekte reduziert werden und sichergestellt wird, dass die Behandlung präziser durchgeführt wird.

Das Verständnis dieser Mechanismen, die der Funktionsweise von CRISPR und Cas9 zugrunde liegen, könnte zu effizienteren Formen der Genbearbeitungstechnologie führen, einschließlich der Fähigkeit, Therapien direkt in den Körper zu verabreichen, und könnte sogar andere Therapien wie die CAR-T-Zelltherapie verbessern.

„Es ist viel einfacher, den vorprogrammierten Cas9-Komplex in Form eines Lipid-Nanopartikels zu verabreichen, um die Zielzellen des Patienten direkt zu modifizieren, wenn wir sicher sein können, dass er seine Aufgabe ordnungsgemäß erfüllt“, sagte Sgourakis. „Zum Beispiel könnte die präzise Genbearbeitung mithilfe der CRISPR-Technologie verwendet werden, um T-Zellen in Patienten direkt zu verändern, was uns die Vereinfachung der Anpassung von CAR-T und anderen Zelltherapien ermöglichen würde.“

Die Kernspinresonanzspektroskopie für diese Studie wurde am Institute for Structural Biology der University of Pennsylvania unter Verwendung gemeinsamer Instrumente der Perelman School of Medicine der University of Pennsylvania und CHOP durchgeführt.