Erweiterungstechnik zur Abbildung nanoskaliger Strukturen in Zellen macht hochauflösende Bildgebung zugänglicher

Eine klassische Möglichkeit, nanoskalige Strukturen in Zellen abzubilden, ist der Einsatz teurer, leistungsstarker Superauflösungsmikroskope. Als Alternative haben MIT-Forscher eine Möglichkeit entwickelt, Gewebe vor der Bildgebung zu vergrößern, eine Technik, die es ihnen ermöglicht, mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop eine Auflösung im Nanomaßstab zu erreichen.

Mit der neuesten Version dieser Technik haben Forscher es ermöglicht, Gewebe in einem einzigen Schritt um das Zwanzigfache zu vervielfachen. Diese einfache und kostengünstige Methode könnte fast allen Biologielabors den Weg für die Durchführung nanoskaliger Bildgebung ebnen.

„Es demokratisiert die Bildgebung“, sagt Laura Kiessling, Novartis-Professorin für Chemie am MIT und Mitglied des Broad Institute of MIT and Harvard sowie des Koch Institute for Integrative Cancer Research am MIT.

„Wenn man ohne diese Methode Dinge mit hoher Auflösung sehen möchte, muss man sehr teure Mikroskope verwenden. Diese neue Technik ermöglicht es Ihnen, Dinge zu sehen, die Sie normalerweise mit Standardmikroskopen nicht sehen könnten. die Kosten für die Bildgebung, da Sie Objekte im Nanomaßstab sehen können, ohne dass eine spezielle Einrichtung erforderlich ist.

Mit der mit dieser Technik erreichten Auflösung von etwa 20 Nanometern können Wissenschaftler Organellen im Inneren von Zellen sowie Proteinklumpen erkennen.

„Eine zwanzigfache Erweiterung führt Sie in den Bereich, in dem biologische Moleküle wirken. Die Bausteine ​​des Lebens sind Dinge im Nanomaßstab: Biomoleküle, Gene und Genprodukte“, erklärt Professor Y. Edward Boyden von der Neurotechnologie am MIT. Professor für Biotechnik, Medienkunst und -wissenschaften sowie Gehirn- und Kognitionswissenschaften; ein Forscher vom Howard Hughes Medical Institute; und Mitglied des McGovern Institute for Brain Research am MIT und des Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Boyden und Kiessling sind Hauptautoren der neuen Studie, die in erscheint Natürliche Methoden. Der MIT-Absolvent Shiwei Wang und Tay Won Shin Ph.D. sind Hauptautoren des Artikels.

Nur eine Erweiterung

Boydens Labor erfand 2015 die Expansionsmikroskopie. Die Technik erfordert das Einbetten von Gewebe in ein absorbierendes Polymer und den Abbau der Proteine, die das Gewebe normalerweise zusammenhalten. Bei Zugabe von Wasser quillt das Gel und trennt die Biomoleküle voneinander.

Die ursprüngliche Version dieser Technik, die das Gewebe vervierfachte, ermöglichte es den Forschern, Bilder mit einer Auflösung von etwa 70 Nanometern zu erhalten. Im Jahr 2017 modifizierte Boydens Labor den Prozess um eine zweite Expansionsstufe, die eine insgesamt 20-fache Expansion ermöglichte. Dies ermöglicht eine noch höhere Auflösung, allerdings ist der Prozess komplizierter.

„Wir haben in der Vergangenheit mehrere 20-fache Expansionstechnologien entwickelt, die jedoch mehrere Expansionsstufen erfordern“, sagt Boyden. „Wenn man eine solche Erweiterung in einem Schritt machen könnte, würde das die Sache ein wenig vereinfachen.“

Bei einer 20-fachen Vergrößerung können Forscher mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop eine Auflösung von etwa 20 Nanometern erreichen. Dadurch können sie Zellstrukturen wie Mikrotubuli und Mitochondrien sowie Proteincluster erkennen.

In der neuen Studie beschlossen die Forscher, das Volumen in einem einzigen Schritt um das 20-fache zu erhöhen. Das bedeutete, dass sie ein Gel finden mussten, das sowohl extrem saugfähig als auch mechanisch stabil ist, damit es bei einer Multiplikation mit 20 nicht auseinanderfällt.

Um dies zu erreichen, verwendeten sie ein aus N,N-Dimethylacrylamid (DMAA) und Natriumacrylat zusammengesetztes Gel. Im Gegensatz zu früheren Expansionsgelen, die auf der Zugabe eines weiteren Moleküls zur Bildung von Vernetzungen zwischen Polymersträngen beruhten, bildet dieses Gel spontan Vernetzungen und weist starke mechanische Eigenschaften auf.

Solche Gelkomponenten wurden zuvor in Protokollen der Expansionsmikroskopie verwendet, die resultierenden Gele konnten sich jedoch nur etwa zehnmal ausdehnen. Das MIT-Team optimierte den Gel- und Polymerisationsprozess, um das Gel robuster zu machen und eine 20-fache Expansion zu ermöglichen.

Um das Gel weiter zu stabilisieren und seine Reproduzierbarkeit zu verbessern, entfernten die Forscher vor der Gelierung Sauerstoff aus der Polymerlösung, wodurch Nebenreaktionen vermieden werden, die die Vernetzung beeinträchtigen. Bei diesem Schritt muss Stickstoffgas durch die Polymerlösung geleitet werden, wodurch der größte Teil des Sauerstoffs im System ersetzt wird.

Sobald sich das Gel gebildet hat, werden einige Bindungen in den Proteinen, die das Gewebe zusammenhalten, aufgebrochen und Wasser wird hinzugefügt, damit das Gel aufquillt. Sobald die Expansion abgeschlossen ist, können Zielproteine ​​im Gewebe markiert und abgebildet werden.

„Dieser Ansatz erfordert im Vergleich zu anderen hochauflösenden Techniken möglicherweise mehr Probenvorbereitung, ist aber im Hinblick auf den eigentlichen Bildgebungsprozess, insbesondere bei der 3D-Bildgebung, viel einfacher“, erklärt Shin. „Wir dokumentieren das Protokoll Schritt für Schritt im Manuskript, damit die Leser es leicht durchgehen können.“

Abbildung winziger Strukturen

Mit dieser Technik konnten Forscher viele winzige Strukturen in Gehirnzellen sichtbar machen, darunter auch Strukturen, die als synaptische Nanosäulen bezeichnet werden. Hierbei handelt es sich um Gruppen von Proteinen, die in einer bestimmten Weise an neuronalen Synapsen angeordnet sind und es Neuronen ermöglichen, über die Sekretion von Neurotransmittern wie Dopamin miteinander zu kommunizieren.

Bei ihren Studien an Krebszellen bildeten die Forscher auch Mikrotubuli ab, hohle Röhren, die den Zellen ihre Struktur verleihen und eine wichtige Rolle bei der Zellteilung spielen. Sie konnten auch Mitochondrien (Organellen, die Energie erzeugen) und sogar die Organisation einzelner Kernporenkomplexe (Proteincluster, die den Zugang zum Zellkern kontrollieren) beobachten.

Wang nutzt diese Technik nun, um Kohlenhydrate, sogenannte Glykane, abzubilden, die sich auf der Oberfläche von Zellen befinden und dabei helfen, die Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung zu steuern. Diese Methode könnte auch zur Abbildung von Tumorzellen eingesetzt werden, wodurch Wissenschaftler viel einfacher als bisher Einblicke in die Organisation von Proteinen in diesen Zellen gewinnen könnten.

Die Forscher gehen davon aus, dass jedes Biologielabor in der Lage sein sollte, diese Technik zu geringen Kosten einzusetzen, da sie auf handelsübliche Standardchemikalien und gängige Geräte wie konfokale Mikroskope und Handschuhtaschen angewiesen ist, die in den meisten Labors bereits vorhanden sind oder leicht zugänglich sind.

„Wir hoffen, dass mit dieser neuen Technologie jedes konventionelle Biologielabor dieses Protokoll mit seinen vorhandenen Mikroskopen nutzen kann und so eine Auflösung erreichen kann, die nur mit sehr speziellen, hochmodernen und teuren Mikroskopen erreicht werden kann.“ “, sagte Wang. .

Diese Geschichte wurde mit freundlicher Genehmigung von MIT News (web.mit.edu/newsoffice/) erneut veröffentlicht, einer beliebten Website, die über Neuigkeiten in Forschung, Innovation und Bildung des MIT berichtet.