Einige CRISPR-Screenings verfehlen möglicherweise die Ziele von Krebsmedikamenten

Die Bearbeitung von CRISPR/Cas9-Genen hat eine Vielzahl biomedizinischer Experimente ermöglicht, darunter Studien, bei denen Krebszellgene systematisch ausgeschaltet werden, um diejenigen zu finden, auf die Krebszellen zum Überleben und Wachstum stark angewiesen sind. Diese Gene oder „Krebsabhängigkeiten“ sind oft vielversprechende therapeutische Ziele. Neue Forschungsergebnisse zeigen jedoch, dass viele dieser CRISPR-Screening-Experimente auf Komponenten namens CRISPR/Cas9-Leitfäden basieren, die in Zellen von Menschen aller Herkunft nicht so gut funktionieren, was dazu führen kann, dass CRISPR-Screenings die Krebsabhängigkeiten übersehen.

Bei diesen CRISPR-Leitfäden handelt es sich um kurze RNA-Sequenzen, die das CRISPR-Enzym Cas9 zu einer bestimmten Stelle im Genom leiten, um DNA zu schneiden und ein Zielgen auszuschalten. Die neuen Erkenntnisse von Wissenschaftlern des Broad Institute of MIT und Harvard zeigen, dass etwa 2 Prozent dieser Leitfäden ihr Ziel verfehlen. Dies bedeutet, dass Cas9 ein bestimmtes Gen nicht schneidet und deaktiviert, wodurch die potenzielle Rolle dieses Gens beim Krebswachstum verschleiert wird. Das Team stellte fest, dass dies in Zellen von Menschen afrikanischer Abstammung unverhältnismäßig häufig vorkommt, da die CRISPR-Leitfäden anhand von Referenzgenomen von Menschen größtenteils europäischer Abstammung entwickelt wurden und nicht die vollständige globale genetische Vielfalt abbilden.

„Diese Ungenauigkeiten existieren an Stellen, die wir möglicherweise nicht erkennen, und auf eine Weise, die wir nicht vorhergesehen hätten“, sagte Rameen Beroukhim, Associate Fellow am Broad und Co-Senior-Autor des Papiers, das kürzlich in erschien Natürliche Kommunikation. „Diese Arbeit zeigt, dass es sich auf jeden Fall lohnt, eine systematische Bewertung aller von uns verwendeten Tools und Datensätze durchzuführen, damit wir diese versteckten Vorurteile korrigieren können, bevor sie zum Problem werden.“

„CRISPR wird überall in der präklinischen Forschung eingesetzt, aber nur eine Minderheit der Forscher denkt sorgfältig über die spezifische Keimbahn und Abstammung ihrer Modellsysteme nach“, fügte Jesse Boehm, Associate Scientist am Broad und Co-Senior-Autor der Studie, hinzu. Papier. „Dies ist eine Warnung an die Community, dass die funktionelle Genomik nicht immun gegen Abstammungsverzerrungen ist, und eine Gelegenheit, sich diese Art von Daten genauer anzusehen.“

In ihrer Studie analysierte das Team Daten aus der Cancer Dependency Map (DepMap) von Broad, der größten Krebsabhängigkeitsressource, die derzeit genomweite Screenings von mehr als 1.000 Krebszellen umfasst, von denen etwa 90 % von Menschen in Europa stammen oder Europa. Ostasiatischer Abstammung.

Francisca Vazquez, Direktorin von DepMap am Broad, sagte, dass weniger als 1 Prozent der DepMap-Leitzelllinienpaare von der in dieser Studie gezeigten Abstammungsverzerrung betroffen seien, es jedoch wichtig sei, diese Verzerrungen in zukünftigen Bibliotheken zu erkennen und zu korrigieren. . Nachdem diese Ergebnisse im Jahr 2022 erstmals als Vorabdruck veröffentlicht wurden, entfernte das DepMap-Team alle nicht funktionierenden Guide-RNAs aus seiner Bibliothek, sodass die Datenbank nicht fälschlicherweise keine Abhängigkeiten für zugewiesene Gene zurückgibt, sondern anzeigt, dass nicht genügend Daten vorhanden sind. Schlussfolgerungen zu ziehen.

Eine neue Art der Suchtforschung

Bisher konzentrierte sich die Forschung zur Krebsabhängigkeit auf genetische Veränderungen, die im Laufe des Lebens eines Menschen in bestimmten Zellen auftreten, sogenannte somatische Mutationen. Doch als der Postdoktorand und Erstautor der Studie, Sean Misek, 2020 in die Labore von Boehm und Beroukhim kam, wollte er wissen, wie genetische Keimbahnvarianten – die vererbt werden und in jeder Zelle des Körpers vorhanden sind – die Reaktion von Tumoren auf die Behandlung beeinflussen.

Misek entdeckte viele starke Zusammenhänge zwischen Abstammung und genetischen Abhängigkeiten und dass die meisten dieser Zusammenhänge von Artefakten im Zusammenhang mit Keimbahnvarianten herrührten. Er beobachtete diese Effekte insbesondere in den CRISPR-Leitfäden. Die Sequenz der Guide-RNAs stimmte nicht ausreichend mit der genetischen Zielsequenz überein, da diese Zielsequenz je nach Abstammung variierte.

Wissenschaftler fanden heraus, dass 89 Prozent der Leitfäden in genomweiten Bibliotheken in mindestens einer Zelllinie eine Nichtübereinstimmung aufweisen. Sie fanden auch heraus, dass Fehlpaarungen in größerem Ausmaß in Zellen von Menschen afrikanischer Abstammung auftreten.

„Diese Art von experimenteller Voreingenommenheit ist in der präklinischen Forschung wahrscheinlich weit verbreitet“, sagte Misek. „Wir hoffen, dass dieses Papier Teil einer breiteren Diskussion ist.“

Für einen Wissenschaftler kann es schwierig sein, das Ausmaß dieser Verzerrung in einem Forschungsprojekt zu verstehen, da es mehrere Tage dauern kann, alle erforderlichen Daten herunterzuladen. Um dieses Problem anzugehen, haben Boehm, Beroukhim und das Pattern-Team am Broad Ancestry Garden erstellt, eine Website, die auf Daten aus der Genome Aggregation Database (gnomAD) basiert und Forschern dabei helfen kann, die Auswirkung der Abstammung auf einen Leitfaden ihrer Wahl zu bestimmen.

„Viele Labore verwenden CRISPR auf die eine oder andere Weise und sollten über einen Mechanismus zur Überprüfung ihrer Reagenzien verfügen“, sagte Misek. „Unser Ziel ist es, es den Menschen ein wenig einfacher zu machen, dieses Problem selbst zu lindern.“

Bibliotheksunterricht

Boehm sagte, dass genetische Variationen aufgrund der Abstammung Auswirkungen auf die Forschung haben, die weit über die Forschung zur Krebssucht hinausgeht, und dass das Ausmaß, in dem sich die Ergebnisse des Teams auf einzelne Studien auswirken werden, unterschiedlich sein wird. Obwohl der Effekt dieser Verzerrung in der DepMap relativ gering war, kann er in Experimenten, die nur eine oder eine kleine Anzahl von Zelllinien untersuchen, viel größer sein, sagte Boehm.

Für die Zukunft sagen das Studienteam und die DepMap-Forscher, dass ein wichtiger Weg, dieser Tendenz entgegenzuwirken, darin besteht, die genetische Vielfalt in großen Zelllinienbibliotheken zu erhöhen.

„Wir ermutigen die Gemeinschaft, uns Zelllinien von unterrepräsentierten Bevölkerungsgruppen zu schicken, wenn sie welche haben“, sagte Vazquez. „Dies ist eine sehr wichtige Frage, die gelöst werden muss.“