Neues Sprühgerät hilft Forschern, sich schnell ändernde zelluläre Prozesse zu erfassen

Zellen sind die Grundeinheiten des Lebens, aber viele ihrer grundlegenden Prozesse laufen so schnell und in so kleinen Maßstäben ab, dass aktuelle wissenschaftliche Instrumente und Methoden nicht mithalten können und uns daran hindern, ein tieferes Verständnis zu entwickeln.

Jetzt haben Forscher des SLAC National Accelerator Laboratory, der Stanford University, der Cornell University und anderen Institutionen einen neuen Ansatz entwickelt, um zu beobachten, wie grundlegende biologische Prozesse ablaufen. Der Ansatz, der kryogene Elektronenmikroskope mit in der Röntgenkristallographie entwickelten Methoden kombiniert, könnte unter anderem zu besseren Medikamenten und einem tieferen Verständnis der Zellteilung, Photosynthese und Wirt-Pathogen-Interaktionen führen.

Ihre Studie wird in der Zeitschrift veröffentlicht Molekularbiologie der Zelle.

„Viele zelluläre Prozesse laufen im Millisekundenbereich ab“, sagte Pete Dahlberg, Wissenschaftler und Mitautor der Studie. „Mit unserer neuen Technik können wir eine Zelle anstechen und dann entscheiden, wann wir ein klares Bild ihrer Reaktion machen möchten.“

Ein leistungsstarkes Sprühgerät neu erfunden

Seit vielen Jahrzehnten verlassen sich Wissenschaftler auf bildgebende Verfahren, die als kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und kryogene Elektronentomographie (Kryo-ET) bekannt sind, um das Innere von Zellen, Proteinen und anderen Organismen und Molekülen zu sehen. Bei beiden Techniken werden Elektronenmikroskope verwendet, um Schnappschüsse von gefrorenen Proben aufzunehmen, die die Zellstrukturen in außergewöhnlicher Detailliertheit zeigen.

Bei diesen Ansätzen wird eine Probe auf eine kleine dünne Scheibe namens Elektronenmikroskopiegitter gelegt und in eine kryogene Flüssigkeit getaucht, um sie sehr schnell einzufrieren. Dies ist großartig, um Zellproben in ihrem ursprünglichen Zustand zu konservieren, eingefrorene Schnappschüsse sagen den Forschern jedoch nicht viel über die Dynamik aus. Es ist ein bisschen so, als würde man versuchen, Tanzschritte zu lernen, indem man zufällig Bilder von jemandem macht, der tanzt.

Derzeit mischen Forscher in ähnlichen Kryo-ET-Experimenten Zellproben manuell, um sie als Reaktion auf Reize abzubilden. Aber das Mischen von Hand braucht Zeit, ähnlich wie das Mischen von Pfannkuchenteig von Hand statt mit einem Elektromixer, was bedeutet, dass Experimentatoren Veränderungen in einem Organismus erst etwa zehn Sekunden in der Zukunft beobachten können, was hunderte Male länger dauert als viele wichtige Prozesse.

„Wenn Sie Zellen in Kryo-ET-Experimenten manuell mischen und einfrieren, sind Sie oft zu langsam, um die Veränderungen zu erfassen, die Sie wirklich interessieren. Dies kann Ihre Fähigkeit, wichtige biologische Prozesse zu verstehen, einschränken“, sagte Cali Antolini, Forscherin am SLAC und Co-Autor des Artikels. sagte.

Deshalb griffen die Forscher auf eine Sprühdüse zurück, die häufig in Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern (XFEL) und Synchrotronanlagen zum Mischen von Proben für Kristallographieexperimente verwendet wird. Das Gerät, bekannt als gasdynamische virtuelle Düse, gekoppelt an einen Mischinjektor (GDVN), wird häufig zur Untersuchung molekularer Bewegungen verwendet, die auf extrem kurzen Zeitskalen stattfinden, beispielsweise Femtosekunden nach der Aktivierung mit Licht oder auf Zeitskalen von Millisekunden bis Sekunden mithilfe einer chemischen Mischung zu XFELs als Linac Coherent Light Source (LCLS) von SLAC.

„Das LCLS-Sputtergerät ermöglicht es Forschern, die Bewegungen von Atomen in Mikrokristallen zu beobachten“, sagte Dahlberg. „Aber meiner Meinung nach sind das Sputtern von Mikrokristallproben und das Sputtern von Zellproben dasselbe.“

„Wir wollten Lichtquellen- und Kryo-ET-Techniken so weit wie möglich kombinieren“, sagte SLAC und Stanford-Professor und Co-Senior-Autor Soichi Wakatsuki. „Wir wussten, dass dies für die Entwicklung der Mikrobiologie und Medizin fruchtbar sein würde.“

Mit ihrem neuen Ansatz pulverisierten und froren die Forscher Zellproben, die mit einem Stimulans gemischt wurden, in Millisekunden ein, statt in 10 Sekunden, die beim manuellen Mischen erforderlich wären. Dadurch konnten die Forscher alle 25 Millisekunden Bilder der Zellprobe aufnehmen und Veränderungen über diesen Zeitraum hinweg beobachten.

„Unser neuer Ansatz hat dazu beigetragen, einige der interessanten morphologischen Veränderungen in Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren, die wir während unserer zeitaufgelösten Experimente zu beobachten begannen“, sagte Jacob Summers, Absolvent der Stanford University und Mitautor des Artikels.

Von Jet bis Nebel

Forscher der Cornell University haben die LCLS-Sprühdüse für das Kryo-ET-Experiment umgestaltet. Aber es war nicht so einfach, das Sputtergerät vom LCLS auf ein Kryo-ET-Gerät umzustellen. Das Problem bestand darin, dass die Proben am LCLS in einem starken Strahl versprüht werden, wie ein Gartenschlauch, der an einer Düse befestigt ist. Diese Kraft und dieser Druck würden für Kryo-ET-Experimente nicht funktionieren, da die Proben auf eine dünne, zerbrechliche Gitteroberfläche gesprüht werden, die unter der Kraft eines Strahlstroms wahrscheinlich auseinanderbrechen würde.

Deshalb passten die Forscher den Gasfluss durch die Düse an, ähnlich wie die Einstellung eines Gartenschlauchs von Strahl auf Nebel. Mit dieser Einstellung erzeugten sie einen feinen Sprühnebel statt eines kräftigen Strahls.

Da es sich um eine relativ neue Technik handele, seien die richtigen Bedingungen für die Erzeugung eines Nebelsprays praktisch unerforscht, sagte Kara Zielinski, Cornell-Forscherin und Mitautorin des Artikels. Sie mussten viele verschiedene experimentelle Bedingungen testen, etwa den Flüssigkeitsstrom, den Gasstrom, den Abstand zwischen Sprühgerät und Gitter und sogar den Gittertyp, um die optimalen Bedingungen für Gitter und eine qualitativ hochwertige Datenerfassung zu finden, sagte sie.

Die Forscher variierten auch die Durchflussraten der Zell- und Stimulationslösungen im Sprühgerät und steuerten so die Geschwindigkeit, mit der sich eine Probe vermischt, und lösten den Takt der Zellreaktionen aus, die die Forscher untersuchen wollten.

Nachdem Forscher diese neue Technik nun nachgewiesen haben, könnte sie auf eine Vielzahl von Fragen zur Strukturdynamik auf zellulärer Ebene angewendet werden, sagte Zielinski.

„Es ist immer spannend, Teil der Entwicklung einer neuen Methode zu sein, denn oft bedeutet dies, völlig neue Wege biologischer Fragen zu eröffnen“, sagte sie. „Die Möglichkeiten sind endlos, denn wir können jetzt die Zelldynamik auslösen, indem wir kleine Moleküle mischen und direkte strukturelle Beweise für ihre Wirkungen erfassen.“

„Ich bin sehr gespannt auf die Ergebnisse, die diese Methode in Zukunft bringen könnte“, sagte Joey Yoniles, Co-Autor der Arbeit und Doktorand an der Stanford University. „Selbst wenn wir wie in dieser Studie nur Bakterien betrachten, könnten wir die Wechselwirkung zwischen Bakterien und Medikamenten mit extrem hoher Auflösung untersuchen.“